产品目录

本试剂盒测定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力，可测血清(浆)、脑脊液、胸水、腹水、肾透析液、尿液、红细胞、白细胞、血小板、心肌培养细胞、肿瘤培养细胞、各种动植物组织细胞及亚细胞水平（线粒体、微粒体）中的超氧化物歧化酶活力，并可检测微生物、药物、食品、饮料、化妆品中的超氧化物歧化酶活力。

任意规格酶标仪（450±10nm波长）、普通一次性96孔微孔板（附送一块）、微量移液器（单道移液器、多道移液器）、37℃恒温孵育箱（或水浴锅）。

• 检测前请仔细阅读说明书，预试后再进行批量实验，否则由此导致的后果用户自行承担。
  
• 试剂盒运输时试剂三不在纸质试剂盒内，而是另有一个泡沫盒装着，收货时请注意查看。
  
• 试剂三如需多次使用，请在第一次解冻后分装好冷冻保存，避免反复冻融。
  
• 测定时试剂三需放置于冰上，实验结束剩余部分及时放回-20℃保存。
  
• 96孔板操作时，轻轻震荡孔板，保证样本与试剂的充分接触。
  
• 正式实验前请做好预试，这步很关键！
  
• 此法抑制率超过60%时，请将样本稀释后再测。

• 底物应用液：按试剂二∶试剂一＝1∶200的比例混合，充分混匀，现用现配，用多少配多少。
  
• 酶工作液：按试剂三∶试剂四＝1∶10的比例混合，充分混匀，现用现配，用多少配多少。

• 血清（浆）样本：观察血清（浆），如有浑浊需3500转/分，离心10分钟，取上清待用，如无则直接使用（直接选取2例进行预实验确定最佳上样浓度）。
  
  全血抗凝时不宜用EDTA，推荐用肝素钠。
  
  
• 动物组织样本：准确称取组织重量，按照重量(g)∶体积(mL)＝1∶9的比例加入9倍体积生理盐水，剪碎组织，冰水浴匀浆，2500～4000转/分钟，离心10分钟，取上清即10%匀浆上清液待测（匀浆上清选取2例进行预实验确定最佳上样浓度，另外还需要测定其蛋白浓度（蛋白浓度可用本公司的BCA法或考马斯亮蓝法测定），用于计算）。
  
• 细胞样本：
  
  • 收集细胞：如果是悬浮培养的细胞，可直接通过离心收集沉淀细胞（1000转/分，离心10分钟，弃上清留沉淀细胞）；如果是贴壁培养的细胞，吸去上清，可通过细胞刮直接将细胞刮下，或者是用0.25%的胰酶室温消化2～3分钟，加培养液终止消化，用微量移液器轻轻吹打，将所有液体吸出转入EP管，然后1000转/分，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞，再加入1mL PBS轻轻吹打，再次1000转/分，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞待用。
    如暂时不做，则可以将细胞低温冻存，温度越低越好。
  • 细胞破碎：
    
    • 第一种方法是研磨破碎：在细胞沉淀中加入一定量（10⁶数量级的细胞一般加0.3～0.5mL）的缓冲液（缓冲液可以用0.01mol/L的PBS或者是生理盐水），用手动玻璃匀浆器冰水浴研磨3～5分钟，或者是用卡富隆电动研磨器冰水浴研磨3分钟；
      
    • 第二种方法是超声破碎(推荐此法)：在细胞沉淀中加入一定量（10⁶数量级的细胞一般加0.3～0.5mL）的缓冲液（缓冲液可以用10mM PBS或者是生理盐水），需保证超声探头在液面以下。功率300W，冰水浴，每次超声3～5秒，间隔4次（每次间隔时间为30秒左右）；
      
    • 第三种方法反复冻融：可以用液氮进行反复冻融，让细胞在EP管或者是冻存管中加入一定量的低渗液或者蒸馏水，直接放入液氮中3～5秒，立即取出转入-20℃冰箱（20～30秒），再取出室温解冻，解冻后再按前面重复3次。
      • 从液氮中取出不可直接置于室温解冻，这样EP管等容易炸裂导致样本损失，所以一定要用冷冻进行梯度解冻。
        
      • 此方法不推荐，因温度高低反复时会影响酶活性。
    • 第四种方法是化学裂解：贴壁培养的细胞，可直接将上清吸去后，直接在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液（推荐用1%～2%的Triton X-100，覆盖满细胞），置冰上裂解30～40分钟（可用显微镜观察细胞破碎情况，如效果不好可延长时间），再用微量移液器吸出待测。
    细胞破碎后如溶液均匀无杂质，可直接使用，无须离心；另外破碎后的匀浆液也需要进行预试且测定其蛋白浓度（蛋白浓度可用本公司的BCA或考马斯亮蓝试剂盒测定），用于计算。
  
  
• 植物组织样本：取植物组织，用蒸馏水洗净表面污垢后，用吸水纸擦干，取适量于研钵中，剪碎，加入适量液氮，快速研磨成粉，取粉末称重，按重量(g)∶体积(mL)＝1∶9的比例，加入9倍体积的PBS(10mM,pH7～7.4)，漩涡混匀3分钟，4000转/分，离心10分钟，取上清即10%匀浆上清液，选取2例待测样本用PBS稀释成不同浓度进行预实验。
  
  对于水分含量较多的植物样本如番茄叶片或一些植物嫩叶等也可参照动物组织样本的前处理方法制成10%（或更高浓度）的匀浆，植物组织匀浆离心后的上清尽量澄清透亮，可适当加大离心转速及离心时间。
  
  
• 全血样本：收集肝素抗凝全血，轻轻颠倒混匀，定量吸取一定量的全血，加入4倍体积的冷蒸馏水，漩涡充分混匀30秒，静置10分钟，充分溶血（对光观察，溶液澄清透亮），即5倍溶血液，再用蒸馏水稀释成不同浓度进行预试验。
  全血抗凝时不宜用EDTA。
• 红细胞样本：收集肝素抗凝全血，轻轻颠倒混匀，离心分离上层血浆（离心转速根据动物种属有区别，如小鼠一般1000～1500转/分，大鼠、兔子一般2000～2500转/分，人一般2500～3000转/分，转速过高可能会导致红细胞破碎，血浆溶血），在下层红细胞中加入3倍体积的生理盐水，轻轻颠倒混匀，500转/分，离心5分钟，弃上清留沉淀红细胞（洗涤红细胞），定量吸取一定量的红细胞，加入9倍体积的冷蒸馏水，漩涡充分混匀30秒，静置10分钟，充分溶血（对光观察，溶液澄清透亮），即10倍溶血液，再用蒸馏水稀释成不同浓度进行预试验。

• 新品种的样本测试前请一定要先摸索其最佳浓度。
  
• 正式实验之前，请挑取2例(正常组+实验组各一个)样本，稀释成不同浓度进行预实验，选取抑制率（抑制率的计算参考计算公式）在40%～50%的(一般选择抑制率接近40%的)这一孔对应的样本浓度，进行正式批量试验（正式实验时，抑制率在10%～60%间都是可以的）。
  
• 相关样本的稀释倍数参考：
  
  • 人血浆：2～10倍稀释；
    
  • 大、小鼠血浆：5～20倍稀释；10%肝（或肾、心肌）匀浆100～500倍稀释；
    
  • 牛血浆：2～10倍稀释；
    
  • 普通动物脑10%匀浆：20～100倍稀释均有；
    
  • 尿液样本：原液至20倍稀释均有；
    
  • 细胞样本：原液至20倍稀释均有；
    
  • 植物叶片：原液至40倍稀释均有；根、茎：原液至5倍稀释；
    
  • 细胞培养液：原液至5倍稀释；
    
  • 普通动物肠10%匀浆：50～100倍稀释；
    
  • 鱼血清：5～20倍稀释；肌肉（或脑）10%匀浆用原液至10倍稀释；肝10%匀浆：100～500倍稀释；
    
  • 唾液：5～50倍稀释；
    
  • 虾蟹血清：原液至50倍均有；肝胰腺10%匀浆：5～20倍稀释；
    
  • 动物粪便10%匀浆：5～20倍稀释；
    
  • 猪血清：5～20倍稀释；肝10%匀浆50～200倍稀释；肌肉10%匀浆20～100倍稀释。
  以上各样本SOD稀释倍数仅供参考，不包括所有情况，样本最佳取样浓度（稀释倍数）需做预试决定，用户可以参考上述稀释倍数来开展预实验。

• 按下表加入各成分配制反应体系。
  

  成分	对照孔	对照空白孔	测定孔	测定空白孔
  待测样本(μL)	-	-	20	20
  蒸馏水(μL)	20	20	-	-
  酶工作液(μL)	20	-	20	-
  酶稀释液(μL)	-	20	-	20
  底物应用液	200μL

  
  
  • 对照孔、对照空白孔一批实验只需要各做1～3孔，测定孔每样做至少一个，而测定空白孔视情况而定(样本有颜色或有浊度差异等干扰因素时需每样都做)，样本间物理性状差异不大（或是样本稀释后差异不大）时可以随机挑选1～3个样本做，计算时取平均值用)，但是做预试时同一样本的不同浓度最好都做相应的测定空白孔。
    
  • 样本每样都做测定空白孔时，试剂能做的样本数减半。
  
  
• 轻轻震荡孔板混匀，37℃孵育20分钟，取出孔板，揭开孔板盖，置于酶标仪450nm处测定各孔吸光值A。

• 活力定义：在本反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个SOD活力单位（U）。
  
• SOD抑制率计算：
  

  SOD抑制率(%)＝(1－	A测定－A测定空白	)×100%
  	A对照－A对照空白

  
  
• 计算公式：
  
  • 血清、血浆、细胞培养上清、果汁等液体样本：
    

    SOD活力(U/mL)＝SOD抑制率(%)÷50%×	V反总	×N
    	V样

    
    
  • 动物组织及普通培养细胞样本：
    

    SOD活力(U/mg蛋白)＝SOD抑制率(%)÷50%×	V反总	×N÷Cpr
    	V样

    
    
  • 植物组织样本（植物组织也可用动物组织计算公式）：
    

    SOD活力(U/g组织)＝SOD抑制率(%)÷50%×	V反总	×N÷	W
    	V样		V样总

    
    
  • 全血、红细胞样本：
    

    SOD活力(U/mgHb)＝SOD抑制率(%)÷50%×	V反总	×N÷CHb
    	V样

  V_反总为反应体系总体积，0.24mL；
  N为样本测试前稀释倍数（样本匀浆处理不算稀释）；
  V_样为操作表中样本加入量，0.02mL；
  Cpr为匀浆液蛋白浓度，mg/mL；
  V_样总为样本前处理时，加入的匀浆介质的总体积，mL；
  C_Hb为溶血液血红蛋白（Hb）浓度，mg/mL。